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鹽酸氯丙嗪對八肋游仆蟲中心蛋白C端功能的抑制

董倩 葉旭文 楊靜 王文明 趙亞琴 楊斌盛

引用本文: 董倩, 葉旭文, 楊靜, 王文明, 趙亞琴, 楊斌盛. 鹽酸氯丙嗪對八肋游仆蟲中心蛋白C端功能的抑制[J]. 無機化學學報, 2021, 37(1): 23-32. doi: 10.11862/CJIC.2021.019 shu
Citation:  DONG Qian, YE Xu-Wen, YANG Jing, WANG Wen-Ming, ZHAO Ya-Qin, YANG Bin-Sheng. Inhibition of Functions for C-Terminal Domain of Euplotes Octocarinatus Centrin by Chlorpromazine Hydrochloride[J]. Chinese Journal of Inorganic Chemistry, 2021, 37(1): 23-32. doi: 10.11862/CJIC.2021.019 shu

鹽酸氯丙嗪對八肋游仆蟲中心蛋白C端功能的抑制

    通訊作者: 楊斌盛。E-mail:yangbs@sxu.edu.cn
  • 基金項目:

    國家自然科學基金(No.21571117)資助

摘要: 通過熒光光譜分析、等溫滴定量熱(ITC)、圓二色譜(CD)、電泳等技術研究了鹽酸氯丙嗪(CPZ)和八肋游仆蟲中心蛋白C端(apoC-EoCen)的結合以及CPZ對蛋白功能的影響。結果表明,在室溫下10 mmol·L-1 Hepes溶液(pH=7.4)中,CPZ與apoC-EoCen以物質的量之比為1:1結合,條件結合常數約為104L·mol-1。CPZ的結合導致蛋白質的二級結構發生改變,α螺旋含量減??;對金屬離子誘導中心蛋白的聚集產生了抑制作用,Tb3+敏化熒光強度也降低;阻礙了中心蛋白與著色性病干皮病C組蛋白(XPC)的結合;且影響了apoC-EoCen類核酸酶活性,導致蛋白對pBR322 DNA的切割能力下降;抑制了蛋白質的磷酸化。綜合實驗結果表明鹽酸氯丙嗪是中心蛋白的生物功能阻斷劑,對中心蛋白的功能具有良好的調控作用。

English

  • 中心蛋白是首次在單細胞綠藻中發現的一種高度保守的鈣離子結合蛋白,屬于鈣調蛋白家族[1]。它廣泛存在于真核生物中,如酵母[2]、無脊椎動物[3]、高等植物[4]、哺乳動物[5]等,是很多生物的中心體重要組成部分,在細胞分裂過程中起著重要作用。中心蛋白含有4個EF-手結構域,每個EF-手結構域可以結合一個鈣離子。當蛋白結合鈣離子后,蛋白構象變得更加開放,疏水區暴露,有利于蛋白和靶肽之間的結合[6]。Tb3+具有與Ca3+相似的配位化學性質,但是其與蛋白質結合后出現明顯的熒光敏化。因此常常被用作Ca3+結合蛋白的離子探針[7]。

    八肋游仆蟲中心蛋白由168個氨基酸殘基組成,其分子量約為20 kD。本實驗室使用Tb3+熒光探針、蛋白質片段等多種方法研究表明,生理條件下每個蛋白質分子可結合4個Ca3+,Tb3+與Ca3+占據相同的結合位點,Ⅲ、Ⅳ位點屬于蛋白和金屬離子結合的高親和位點;蛋白與金屬離子結合后使得蛋白質從封閉狀態到開放狀態,從而導致疏水表面暴露,蛋白質聚集;八肋游仆蟲中心蛋白的N端在金屬離子介導的聚集過程中扮演了重要的角色[8],而與靶肽的結合完全發生于C端[9];中心蛋白還可以參與核苷酸切除修復[10]。

    鹽酸氯丙嗪(CPZ)是一種吩噻嗪類臨床藥物[11],其分子結構如圖 1所示。它主要作為抗組胺藥和安定劑使用,是一種具有多種作用的通用型抗精神病藥。其一個重要特征是可以在不損傷人的大腦意識的情況下控制過度興奮和狂躁,改變精神病患者的異常行為。小劑量的CPZ也可以緩解嘔吐, 對于鎮定、降溫和抗休克效果明顯。此外,在生物醫學研究中CPZ常被用作為鈣調蛋白抑制劑[12],可以與鈣調蛋白結合,從而抑制鈣調蛋白的功能。本實驗室曾報道另一種吩噻嗪類臨床藥物——三氟拉嗪與八肋游仆蟲中心蛋白N端半分子的結合及對蛋白質功能的影響[13]。本文報道CPZ與八肋游仆蟲中心蛋白C端半分子的結合及對蛋白質功能的影響,深入了解其在分子水平上的相互作用,有助于理解藥物結合的熱力學和機制,可以為醫學研究做出一定的貢獻。

    圖 1

    圖 1.  鹽酸氯丙嗪的結構
    Figure 1.  Structure of chlorpromazine

    GST親和層析柱材料(Glutathione SepharoseTM 4 Fast Flow)來自GE Healthcare,N-2-羥乙基哌嗪-N'-乙磺酸(Hepes分析純)、CPZ均來自Sigma公司,氯化鉀(>99%)、Tris(>99.9%)、甘氨酸(>99.5%)、Acrylamide (>99.9%)、N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、bis-acrylamide(純度大于99.0%)均來自上海生工,乙二胺四乙酸鈉(EDTA)來自索萊寶,過硫酸銨(分析純)來自北京化工廠。

    所用儀器有:Eppendorf移液槍、THZ-C搖床(江蘇太倉實驗設備廠)、KS-600超聲波粉碎機(寧波儀器廠)、TGL-16臺式高速冷凍離心機(湖南儀器總廠)、F-2700型熒光光譜儀(日本Hitachi公司)、F-2700型熒光分光光度計(日本Hitachi公司)、Chirascan圓二色光譜儀(Applied Photophysics有限公司)、Mal- vern ITC200等溫滴定微量熱儀、Cary Varian Eclipse紫外分光光譜儀、METTLER TOLEDO Five easy plus pH計、DYCZ-24DN型迷你雙垂直電泳和DYY-10C型雙穩時電泳儀(北京市六一儀器廠)。

    1.2.1   儲備液的配制

    Tb3+儲備液的配制參照文獻[14]進行。

    CPZ溶液的配制:準確稱取0.177 7 g的CPZ加入1 mL的Hepes溶液(10 mmol·L-1,pH=7.4)中,攪拌均勻至溶解,配制成0.5 mmol·L-1的CPZ溶液,避光保存備用。

    pBR322 DNA儲備液的配制:在無菌環境下用移液槍取一定量的pBR322 DNA(濃度為0.5 μg· μL-1),用無菌水稀釋至所需濃度,并將其分裝儲備于-20 ℃下。

    1.2.2   熒光光譜分析

    CPZ和apoC-EoCen作用的熒光通過熒光光譜儀測定[15]。隔3 min掃描1次,記錄保存相關數據。同樣可以測定Tb3+的敏化熒光光譜。

    1.2.3   等溫滴定量熱分析

    apoC-EoCen與CPZ結合的熱力學常數通過等溫量熱分析得到,實驗在30 ℃下進行[16]。apoC- EoCen濃度為0.08 mmol·L-1,CPZ濃度為4 mmol· L-1,分別將其置于樣品池及注射器中。

    1.2.4   CD色譜的測定

    通過Biologic Mos型CD光譜儀測定圓二色光譜(CD),掃描范圍為190~260 nm,樣品均溶解于Hepes緩沖溶液(10 mmol·L-1,pH=7.4)中[17]。所有實驗均在室溫下進行,掃描3次取平均值,扣除稀釋效應。

    1.2.5   共振光散射測定

    共振光散射(RLS)通過掃描同步熒光光譜實現。設定激發波長為250 nm,掃描范圍為250~600 nm,電壓為400 V, 激發和發射狹縫均為10 nm。取1 mL apoC-EoCen和不同濃度的CPZ混合溶液于1 cm的比色皿中,apoC-EoCen濃度為10 μmol·L-1,然后加入1 mmol·L-1的Tb3+,每次加2 μL,隔3 min掃描1次,最終結果為3次掃描結果的平均值。

    1.2.6   apoC-EoCen的磷酸化修飾

    將apoC-EoCen(0.1 mmol·L-1)、蛋白激酶A (protein kinase A,PKA,0.1 mmol·L-1)、Mg2+ (0.132 mol·L-1)、ATPNa2(1.01 mmol·L-1)均溶解于Hepes緩沖溶液(10 mmol·L-1,pH=7.4)中,分別加入0、5、10、30、50倍的CPZ,置于恒溫水浴(30 ℃)反應10 h,得到磷酸化蛋白(P-apoC-EoCen)。利用PD-10脫鹽柱將多余的金屬離子和ATP等洗脫。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳來檢測蛋白的電遷移率[18]。

    1.2.7   聚丙烯酰胺凝膠電泳

    將提前制備好的apoC-EoCen和XPC混合樣品放置于4 ℃過夜反應,apoC-EoCen的電遷移率在室溫下用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測,電泳時間約3 h完成,用考馬斯亮藍R-250染色, 然后用乙醇或冰乙酸脫色后在紫外可見透射反射儀中觀察。

    1.2.8   瓊脂糖凝膠電泳分析

    pBR322 DNA、apoC-EoCen和CPZ按一定比例混合,在4 ℃反應約3 h,通過瓊脂糖凝膠電泳實驗研究apoC-EoCen、CPZ和pBR322 DNA三者之間的相互作用。實驗結果置于紫外可見透射反射儀下進行觀察[13]。

    1.2.9   分子對接

    apoC-HsCen 2與apoC-EoCen的序列同源性高達71.8%,與鈣調蛋白的同源性也在50%以上[19]。如此高的同源性使得它們之間的生物功能基本相似,因此我們選擇apoC-HsCen 2(PDB:2GGM)的結構作為模板, 利用自動對接軟件Discovery Studio 3.0 (DS)對小分子CPZ與C端半分子之間的結合位點和結合模式進行模擬,找到最優結合位點,即能量最低位點[20]。這種研究方法的優點在于在實驗基礎上可以直觀地看到兩者之間的結合狀態。

    2.1.1   熒光光譜

    圖 2A是在pH=7.4、10 mmol·L-1 Hepes緩沖條件下,用CPZ滴定apoC-EoCen的熒光光譜。從圖 2A可以看出,308 nm處是apoC-EoCen的最大熒光發射峰。隨著CPZ滴加到apoC-EoCen溶液中,可以看到位于308 nm處的C端半分子蛋白熒光強度逐漸下降,而在355和452 nm處出現了CPZ的2個特征熒光峰,并在335 nm處出現了等熒光點。表明CPZ與apoC-EoCen結合生成了復合物。

    圖 2

    圖 2.  (A) CPZ (2.5 mmol·L-1)的加入對apoC-EoCen(10 μmol·L-1, 1 mL)熒光光譜的影響; (B)隨cCPZ/capoC-EoCen變化的熒光強度(308 nm)滴定曲線, 以及CPZ滴定apoC-EoCen的擬合曲線
    Figure 2.  (A) Fluorescence spectra produced by addition of CPZ (2.5 mmol·L-1) to 1 mL apoC-EoCen (10 μmol·L-1); (B) Titration curve of fluorescent intensity at 308 nm against concentration ratio of CPZ and apoC-EoCen

    Concentration of CPZ from a to u was 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 μmol·L-1, respectively; All experiments were carried out in 10 mmol·L-1 Hepes buffer (pH=7.4); Inset: plot of lg[(F0-F)/(F-F)] vs lg cCPZ, f and fitting curve

    將apoC-EoCen在308 nm處的熒光強度對cCPZ/ capoC-EoCen作圖,得到圖 2B。從圖 2B可以看出,apoC- EoCen在308 nm處的熒光強度隨著cCPZ/capoC-EoCen的增大而逐漸減小。利用CPZ與apoC-EoCen反應形成apoC-EoCen-CPZ復合物的平衡方程,可將熒光強度與反應表觀結合常數、結合位點數建立式1所示方程:

    $ \lg \left[ {\left( {{F_0} - F} \right)/\left( {F - {F_\infty }} \right)} \right]n\lg {c_{{\rm{CPZ, f}}}} + \lg K $

    (1)

    其中F0為apoC-EoCen在308 nm處的初始熒光強度;F為任一滴定點的熒光強度;F為CPZ與apoC- EoCen完全結合后apoC-EoCen在308 nm處的熒光強度;K為CPZ與apoC-EoCen結合的條件結合常數;n為apoC-EoCen的CPZ結合位點數;cCPZ, f為任一滴定點時CPZ的游離濃度。根據文獻[21],使用CPZ的總濃度代替CPZ的游離濃度,由式1用lg[(F0-F)/(F-F)]對lg cCPZ, f作圖可得近似的Kn(圖 2B,Inset)。CPZ與apoC-EoCen的結合比為1:1,結合常數為(1.91±0.04)×104 L·mol-1 (Supporting information)。

    2.1.2   等溫滴定量熱分析

    為了進一步研究CPZ和apoC-EoCen之間的相互作用,我們選用等溫量熱滴定進行分析。圖 3為室溫下在Hepes緩沖溶液(10 mmol·L-1,pH=7.4)中CPZ滴定apoC-EoCen的等溫量熱滴定曲線。通過單位點結合模型擬合,獲得結合常數為(1.12±0.15)× 104 L·mol-1,apoC-EoCen有1個CPZ的結合位點,與前面的熒光滴定結果一致。熱力學參數列于表 1,可以看出熵是正數、焓是負數、吉布斯自由能是負數,表明CPZ和apoC-EoCen反應的過程是焓熵共同驅動的自發放熱反應,它們之間反應的主要作用力是靜電作用[22]。

    圖 3

    圖 3.  25 ℃下CPZ (3 mmol·L-1)對apoC-EoCen (0.08 mmol·L-1)的等溫量熱滴定曲線
    Figure 3.  Calorimetric titration curve of CPZ (3 mmol·L-1) to apoC-EoCen (0.08 mmol·L-1) at 25 ℃

    表 1

    表 1  25 ℃下通過ITC和熒光光譜測量CPZ與apoC-EoCen結合的熱力學數據
    Table 1.  Thermodynamics data of CPZ binding with apoC-EoCen measured by ITC and fluorescence spectrometry at 25 ℃
    下載: 導出CSV
    Method K / (L·mol-1) n ΔS / (J·mol-1) ΔH / (kJ·mol-1) ΔG / (kJ·mol-1)
    ITC (1.12±0.15)×104 1 55.2 -6.77±0.81 -23.51
    Fluorescence (1.91±0.04)×104 0.9
    2.1.3   CD光譜分析

    在室溫、pH=7.4、10 mmol·L-1 Hepes緩沖溶液下測得的apoC-EoCen和apoC-EoCen-CPZ復合物的遠紫外圓二色譜如圖 4所示。由圖 4可見,apoC-EoCen的CD光譜在208和222 nm附近出現了2個負吸收峰,這是中心蛋白由α螺旋結構組成的2個特征峰。加入10倍的CPZ并形成apoC-EoCen-CPZ復合物后,2個峰的負吸收減少,中心蛋白的α螺旋含量降低了約40%,說明鈣調蛋白抑制劑CPZ的結合,對中心蛋白的二級結構產生了影響,導致α螺旋部分解旋,橢圓率降低。

    圖 4

    圖 4.  apoC-EoCen和apoC-EoCen-CPZ復合物在水中的遠紫外CD光譜
    Figure 4.  Far-UV CD spectra of apoC-EoCen and apoC- EoCen-CPZ complex in aqueous solution

    Condition: 10 mmol·L-1 Hepes buffer, pH=7.4, 25 ℃; Ratio of CPZ added to apoC-EoCen (25 μmol·L-1): 0 (a), 10 (b)

    2.1.4   CPZ與apoC-EoCen之間的福斯特共振能量轉移及分子模擬

    根據福斯特非輻射能量轉移理論[23],能量供體和受體發生能量轉移的條件有2個:一是供體的熒光發射光譜和受體的紫外吸收光譜存在著一定的重疊;二是供體和受體之間的距離r < 7 nm,二者不可缺一。圖 5A為室溫下在290~355 nm范圍內供體apoC-EoCen的熒光發射光譜和受體CPZ的紫外吸收光譜的光譜重疊。由此計算得到光譜重疊積分J為2.69×10-15 cm6,已知K2=2/3,n=1.336,Φ=0.14[24],由此得到福斯特臨界能量轉移距離R0為2 nm,能量轉移效率E=0.91,進一步計算得到能量供體apoC- EoCen的168位酪氨酸殘基和受體CPZ之間的距離r為1.36 nm (Supporting information)。0.5R0 < r < 1.5R0,證明蛋白供體和CPZ之間發生了無輻射能量轉移。

    圖 5

    圖 5.  (A) apoC-EoCen熒光光譜(a)和CPZ吸收光譜的重疊(b); (B) apoC-EoCen和CPZ的分子對接圖
    Figure 5.  (A) Overlap of apoC-EoCen fluorescence spectrum (a) and CPZ absorption spectrum (b); (B) Molecular docking between apoC-EoCen and CPZ

    Cartoon ribbon model structure of apoC-EoCen; Black dotted line represents the distance between Tyr and CPZ; green: apoC-EoCen, yellow: CPZ, purple: Tyr

    在實驗測定的基礎上,通過自動對接軟件Dis- covery Studio 3.0可以更加直觀地看到CPZ與apoC- EoCen之間的結合位點以及結合模式。圖 5B是最小結合能為-36.88 kJ·mol-1時對應的結構。如圖 5B所示,CPZ的吩噻嗪環和第4個EF-hand結構域的F螺旋上的168位酪氨酸殘基芳環之間的距離是1.38 nm,與福斯特能量轉移得到的結果吻合。仔細分析CPZ與apoC-EoCen之間結合的驅動力可知其分為2種:(1)靜電作用,質子化的吩噻嗪與去質子化的E144間的作用。(2)疏水作用,CPZ與F109、L122、M141、I142、F145、I153、I161、T165、M162、S166間的作用。除F109和L122分別位于第3個EF-hand結構域的E和Fα-螺旋之外,其它10個氨基酸殘基均位于第4個EF-hand結構域,其中9個氨基酸殘基分別位于第4個EF-hand結構域的E和Fα-螺旋,I153是唯一位于loop區的氨基酸殘基。

    2.2.1   對Tb3+結合的影響

    八肋游仆蟲中心蛋白不含色氨酸殘基,含有4個酪氨酸殘基Y46、Y72、Y79和Y168,分別位于第Ⅰ、Ⅱ結構域和蛋白質的末端。因此,當Tb3+與蛋白質結合時,占據Ⅲ和Ⅳ結合位點(高親和位點)的Tb3+出現弱熒光敏化,而占據Ⅰ和Ⅱ結合位點(低親和位點)的Tb3+出現強熒光敏化[25]。由此得出八肋游仆蟲中心蛋白的4個金屬離子結合部位是不等價的,結合順序為Ⅳ≈Ⅲ>Ⅰ、Ⅱ[26]。C端半分子的酪氨酸殘基只有1個,當用Tb3+滴定時仍可觀測到在490、545、590和620 nm附近出現的Tb3+特征峰(圖 6A)??梢?,隨著Tb3+的不斷加入,其在490、545、590和620 nm處的特征峰熒光強度逐漸增大,直至不變。這表明Tb3+與apoC-EoCen結合后發生了Y168殘基與結合Tb3+間的非輻射能量轉移。將545 nm處的熒光強度對cTb3+/capoC-EoCen作圖(圖 6C曲線a),可以看出,cTb3+/capoC-EoCen < 1.0時,Tb3+在545 nm處熒光強度隨著cTb3+/capoC-EoCen的增加而線性地增加;在cTb3++/capoC-EoCen為1.0~2.0范圍內,盡管Tb3+在545 nm處熒光強度仍隨著cTb3+/capoC-EoCen的增加而線性地增加,但增加幅度明顯減少;當cTb3+/capoC-EoCen>2.0時,Tb3+在545 nm處熒光強度不再隨著cTb3+/capoC-EoCen的增加而增加。表明Tb3+和apoC-EoCen以2:1的結合比結合。在Ⅲ和Ⅳ結構域分別引入色氨酸殘基的研究表明,Tb3+優先占據蛋白質的第Ⅳ結合位點[27],即結合于第Ⅳ結合位點的Tb3+出現強熒光敏化,而結合于第Ⅲ結合位點的Tb3+出現弱熒光敏化。圖 6B是在10倍CPZ存在的條件下,用Tb3+滴定apoC-EoCen的熒光光譜。同樣將545 nm處的熒光強度對cTb3+/capoC-EoCen作圖(圖 6C曲線b)。由該曲線可得,當cTb3++/capoC-EoCen < 1.0時,Tb3+在545 nm處熒光強度隨著cTb3+/capoC-EoCen的增加而線性地增加;當cTb3+/capoC-EoCen>1.0時,Tb3+在545 nm處熒光強度不再隨著cTb3+/capoC-EoCen的增加而增加。表明Tb3+和apoC-EoCen-CPZ以1:1的結合比結合,即CPZ與apoC-EoCen的結合導致Tb3+的1個結合部位被破壞。由圖 6C曲線b的斜率及圖 5B分子對接的CPZ作用部位可推斷,CPZ與apoC-EoCen的結合導致其第Ⅳ結合部位喪失Tb3+結合能力。

    圖 6

    圖 6.  在CPZ不存在(A)和存在(B)的情況下Tb3+敏化的熒光光譜; (C)在CPZ不存在(a)和存在(b)的情況下, Tb3+在545 nm處的熒光強度與cTb3+/capoC-EoCen的關系; (D) Tb2-apoC-EoCen和Tb-apoC-EoCen-CPZ的遠紫外CD光譜
    Figure 6.  Tb3+ sensitized fluorescence spectra in the absence (A) and presence (B) of CPZ; (C) Fluorescence intensity of Tb3+ at 545 nm as a function of cTb3+/capoC-EoCen in the absence (a) and presence (b) of CPZ; (D) Far-UV CD spectra of Tb 2-apoC-EoCen and Tb-apoC-EoCen-CPZ

    Condition: (A) Titrating apoC-EoCen with 1 mmol·L-1 Tb3+, the protein concentration was 10 μmol·L-1, from a to h, the ratios of Tb3+ added to apoC-EoCen were 0, 0.33, 0.66, 1, 1.33, 1.66, 2, 2.33, respectively; (B) cCPZ/capoC-EoCen=10, the experiment condition was the same as A; (C) Fluorescence intensity selected at 545 nm in Fig.A as curve a, and fluorescence intensity at 545 nm in Fig.B as curve b; (D) Ratios of CPZ added to Tb 2-apoC-EoCen were 0 (a), 10 (b), respectively, capoC-EoCen=25 μmol·L-1

    根據式1擬合圖 6C的Tb3+熒光敏化數據可得,在10 mmol·L-1 Hepes、pH=7.4的條件下,Tb3+與apoC -EoCen的結合位點數n為2.04±0.25,條件結合常數K為1.70×1016 L2·mol-2;而Tb3+與apoC-EoCen-CPZ的結合位點數n為1.09±0.06,條件結合常數K為2.00× 108 L·mol-1 (Supporting information),與Ⅲ和Ⅳ結構域分別引入色氨酸殘基后所測得的結合常數吻合[28]。

    圖 6D是10 mmol·L-1 Hepes、pH=7.4條件下Tb2- apoC-EoCen和Tb-apoC-EoCen-CPZ的CD光譜??梢钥闯?,在10倍CPZ的存在下,位于208和220 nm處蛋白質的2個負吸收峰減少近40%,即CPZ的結合使蛋白質的分子結構發生改變,α螺旋含量降低。

    2.2.2   CPZ對apoC-EoCen聚集的影響

    中心蛋白的生物功能之一是金屬離子結合誘導的蛋白質聚集[29]。盡管其聚集驅動力主要集中在N端,但是C端也有一定的聚集能力[30]。圖 7A是在室溫、pH=7.4、10 mmol·L-1 Hepes緩沖溶液時,用Tb3+滴定apoC-EoCen的RLS光譜??梢?,隨著Tb3+的不斷加入,280 nm處的RLS強度逐漸增強。增大到某一點時,基本保持穩定。將280 nm處的RLS強度對cTb3+/capoC-EoCen作圖(圖 7B曲線a),可以發現類似于圖 6的Tb3+敏化熒光滴定,Tb3+和apoC-EoCen以2: 1的結合比結合。由Tb3+滴定apoC-EoCen-CPZ的RLS光譜可得其滴定曲線如圖 7B曲線b所示,即Tb3+與apoC-EoCen-CPZ的結合比為1:1。根據式1擬合圖 7B的Tb3+誘導RLS數據可得,在10 mmol·L-1 Hepes、pH=7.4的條件下,Tb3+與apoC-EoCen的結合位點數n為1.95±0.10,條件結合常數K為1.15×1016 L2·mol-2;而Tb3+與apoC-EoCen-CPZ的結合位點數n為1.00±0.06,條件結合常數K為2.14×108 L·mol-1 (Supporting information),與Tb3+敏化熒光所得結果一致。

    圖 7

    圖 7.  (A) Tb3+滴定apoC-EoCen的RLS光譜; (B)在CPZ比例不同(cCPZ/capoC-EoCen=0 (a), 10 (b))的情況下, RLS光譜在280 nm處的強度與cTb3+/capoC-EoCen的關系
    Figure 7.  (A) RLS spectra of apoC-EoCen titrated with Tb3+; (B) RLS intensity at 280 nm as a function of cTb3+/capoC-EoCen in the presence of different proportions of CPZ: cCPZ/capoC-EoCen=0 (a), 10 (b)

    apoC-EoCen concentration was 10 μmol·L-1; apoC-EoCen was titrated with 1 mmol·L-1 Tb3+, and the experiments were performed in Hepes (10 mmol·L-1, pH=7.4); from a to h, the ratios of Tb3+ added to apoC-EoCen were 0, 0.33, 0.66, 1, 1.33, 1.66, 2, 2.33, respectively

    2.2.3   CPZ對apoC-EoCen類核酸酶活性的抑制
    2.2.3.1   apoC-EoCen的類核酸酶活性

    pBR322 DNA質粒是一種超螺旋型(Ⅰ)核酸大分子,能夠被一些具有切割活性的小分子、蛋白等切割成切口型(Ⅱ)以及線型(Ⅲ)。它們具有不同的遷移速率,其大小順序一般為超螺旋型>線型>缺刻型。圖 8A為不同濃度的apoC-EoCen對pBR322 DNA切割的凝膠電泳圖。1~10號泳道為pBR322 DNA,2~ 10號泳道為分別加入2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、25 μmol·L-1 apoC-EoCen后的pBR322 DNA。從圖 8A中可以看出,最初DNA只有超螺旋一種形式,隨著apoC-EoCen濃度的增大,線型和缺刻型條帶逐漸變亮,而超螺旋DNA條帶慢慢變暗,即DNA逐漸由超螺旋狀態變為線型和缺刻型,直到超螺旋型完全消失。將圖 8A中3種不同形式的DNA進行黑度掃描并對apoC-EoCen濃度作圖得到圖 8B。從圖 8B可以看出,當apoC-EoCen終濃度為25 μmol·L-1時,pBR322 DNA完全由Ⅰ型轉變為Ⅱ和Ⅲ型。即apoC -EoCen像apoN-EoCen[31]一樣有類核酸酶活性。

    圖 8

    圖 8.  (A) apoC-EoCen切割pBR322 DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖; (B)不同構型DNA的比例與apoC-EoCen濃度的關系
    Figure 8.  (A) Agarose gel electrophoresis for pBR322 DNA cutting with different concentrations of apoC-EoCen; (B) Relationship between proportion of different configurations pBR322 DNA and apoC-EoCen concentration

    10 mmol·L-1 Hepes, pH=7.4, 4 ℃ reaction for 3 h; lane 1: pBR322 DNA, lanes 2~10: 0.003 5 g·L-1 pBR322 DNA added with 2.5, 5, 7.5, 10, 12.5, 15, 17.5, 20 and 25 μmol·L-1 apoC-EoCen, respectively, Vtotal=10 μL

    2.2.3.2   不同濃度CPZ對apoC-EoCen類核酸酶活性的影響

    圖 9A是不同濃度CPZ對apoC-EoCen類核酸酶活性的影響。其中1~10號泳道為相同濃度的pBR322 DNA,2~10號泳道為加入終濃度為25 μmol·L-1的apoC-EoCen,3~10號泳道為含有不同濃度CPZ的apoC-EoCen類核酸酶活性,cCPZ/capoC-EoCen分別為5、10、15、20、25、30、40、50。由圖中可見,隨著CPZ濃度的增大,線型和切口型pBR322 DNA條帶逐漸由亮變暗,直到消失;而超螺旋型pBR322 DNA逐漸出現,其條帶逐漸變亮。說明CPZ和apoC- EoCen的結合抑制了apoC-EoCen的類核酸酶活性,阻礙了其對pBR322 DNA的切割,使得pBR322 DNA保存為最初的超螺旋形式。將圖 9A中3種不同形式的pBR322 DNA進行黑度掃描并對cCPZ/capoC-EoCen作圖得到圖 9B。從圖 9B可以看出,開始蛋白將DNA切割成Ⅱ和Ⅲ型DNA,隨著CPZ濃度的增大,Ⅱ和Ⅲ型DNA均逐漸減少,Ⅰ型DNA逐漸增加;當加入20倍的CPZ時,Ⅲ型DNA基本消失;當加入50倍CPZ時,僅剩下Ⅰ型DNA。

    圖 9

    圖 9.  (A) CPZ對apoC-EoCen裂解DNA影響的瓊脂糖凝膠電泳圖; (B)不同構型DNA的比例隨cCPZ/capoC-EoCen變化的曲線
    Figure 9.  (A) Agarose gel electrophoresis for effect with different proportions of CPZ on apoC-EoCen cleavaging DNA; (B) Relationship between proportion of different configurations pBR322 DNA and cCPZ/capoC-EoCen

    10 mmol·L-1 Hepes, pH=7.4, at 4 ℃ for 3 h, total volume: 10 μL; Lane 1: pBR322 DNA, lanes 2~10: pBR322 DNA+apoC-EoCen, lanes 3~10: pBR322 DNA+apoC-EoCen+CPZ (cCPZ/capoC-EoCen)=5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, respectively; final pBR322 DNA concentration: 0.003 5 g·L-1

    2.2.4   CPZ對apoC-EoCen與靶肽結合的抑制

    XPC是以人著色性干皮病C組蛋白中覆蓋中心蛋白結合序列的多肽,它參與許多細胞內生物分子反應。在pH=7.4、10 mmol·L-1 Hepes緩沖條件下,XPC和apoC-EoCen可形成1:1的復合物。圖 10A是CPZ對apoC-EoCen-XPC復合物影響的天然凝膠電泳圖。其中1號泳道為apoC-EoCen,2號泳道為apoC-EoCen-XPC,3~10號泳道是cCPZ/capoC-EoCen分別為5、10、20、30、40、50、100、200時的apoC-EoCen-XPC。由圖 10A可見,隨著CPZ濃度的增加,apoC-EoCen- XPC復合物逐漸減少,直到復合物全部消失,而apoC-EoCen條帶逐漸從無到有。這表明CPZ的結合抑制了apoC-EoCen-XPC復合物的形成。將圖 10A中蛋白及其復合物進行黑度掃描并對cCPZ/ capoC-EoCen作圖(圖 10B),其中曲線a為apoC-EoCen隨CPZ濃度的變化,曲線b為apoC-EoCen-XPC隨CPZ濃度的變化。從圖 10B可以看出,隨著CPZ濃度的增大,曲線a呈上升趨勢,曲線b呈下降趨勢,CPZ抑制了蛋白和XPC的結合,使得復合物含量逐漸下降。當加入50倍的CPZ時,apoC-EoCen和apoC- EoCen-XPC復合物含量基本各占一半。

    圖 10

    圖 10.  (A) 不同比例的CPZ加入apoC-EoCen和XPC中的天然凝膠電泳圖; (B) apoC-EoCen (a)和apoC-EoCen-XPC (b)隨cCPZ/capoC-EoCen的變化; (C)遠紫外CD光譜中CPZ對apoC-EoCen與XPC復合物的影響(a: apoC-EoCen; b: apoC-EoCen-XPC復合物; c: apoC-EoCen-XPC與CPZ共存); (D) apoC-EoCen與XPC或CPZ結合的緞帶模型
    Figure 10.  (A) Non-denaturing gel electrophoresis diagram for effect of adding CPZ with different proportions to apoC-EoCen combined with XPC; (B) apoC-EoCen (a) and apoC-EoCen-XPC (b) changes with cCPZ/capoC-EoCen; (C) Far-UV CD spectra for effect of CPZ on apoC-EoCen binding to XPC (a: apoC-EoCen; b: apoC-EoCen-XPC complex; c: apoC-EoCen-XPC combined with CPZ); (D) Cartoon ribbon model structure of apoC-EoCen combined with XPC and CPZ

    Condition: (A) 10 mmol·L-1 Hepes, pH=7.4, at 4 ℃ for 6 h, total volume=10 μL, protein concentration=200 μmol·L-1; (C) protein concentration=25 μmol·L-1, target peptide ratio=1:1, CPZ concentration=250, 750 μmol·L-1, total volume= 300 μL at 25 ℃; (D) apoC-EoCen (blue), XPC (purple), CPZ (green)

    中心蛋白C端結構域是其靶蛋白結合功能區,許多靶肽如蜂毒素[32]、XPC[33]在溶液中處于隨機卷曲態,當與中心蛋白結合后便形成α-螺旋結構。圖 10C譜線a是apoC-EoCen的遠紫外CD光譜,可見在208和220 nm處出現蛋白質α-螺旋結構的特征峰;當apoC-EoCen與XPC結合形成apoC-EoCen-XPC復合物后,位于208和220nm處的2個特征負峰明顯增大(譜線b),α-螺旋結構含量增加;CPZ與apoC- EoCen結合導致蛋白質α-螺旋結構含量減少;圖 10C譜線c是apoC-EoCen-XPC中加入10倍CPZ后的遠紫外CD光譜,可知apoC-EoCen的α螺旋含量減少約25%。這些結果表明CPZ的結合抑制了apoC-EoCen和XPC形成復合物。

    圖 10D是apoC-EoCen和CPZ結合能量最低結構與apoC-EoCen-XPC晶體結構(PDB:2GGM)的疊加圖。由圖 10D可見,CPZ與XPC的N端占據apoC- EoCen的同一結合部位,尤其是存在XPC的色氨酸殘基與apoC-EoCen間的疏水作用。因此,CPZ與apoC-EoCen-XPC的結合可看作配體的置換反應,CPZ將蛋白質結合的XPC置換。由此,可根據apoC- EoCen-XPC的結合常數計算得到CPZ與apoC-EoCen間的結合常數為5.52×104 L·mol-1 (Supporting infor- mation),與其它方法所得數據吻合。

    2.2.5   CPZ對apoC-EoCen磷酸化的抑制

    蛋白質磷酸化是重要的生物化學反應過程,通過蛋白激酶的催化將ATP上的γ-磷?;D移到蛋白質底物的絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)或酪氨酸(Tyr)殘基上來實現中心蛋白的磷酸化[34]。根據我們實驗室之前的研究,蛋白激酶A(PKA)在apoC-EoCen上的磷酸化位點是Ser-166(KQTS)[35]。CPZ作為鈣調蛋白抑制劑,通過聚丙烯凝膠電泳實驗可以研究其是否對磷酸化蛋白質有影響。如圖 11所示,apoC-EoCen終濃度為100 μmol·L-1,1~6號泳道加apoC-EoCen,2~6號泳道加磷酸化溶液混合物(Mg2+與ATP及PKA),3~6號泳道加不同濃度的CPZ,cCPZ/capoC-EoCen=5、10、30、50。蛋白質經過磷酸化后條帶下移,當加入5倍和10倍的CPZ時,P-apoC-EoCen條帶沒有發生明顯變化,當加入30倍CPZ時,P-apoC-EoCen完全轉化為apoC-EoCen。說明CPZ的結合抑制了磷酸化蛋白質的形成,阻礙了蛋白質的磷酸化。

    圖 11

    圖 11.  CPZ對apoC-EoCen磷酸化影響的聚丙烯凝膠電泳圖
    Figure 11.  Polypropylene gel electrophoresis diagram for effect of CPZ on apoC-Eocen phosphorylation

    10 mmol·L-1 Hepes, pH=7.4, 30 ℃ reaction in a water bath for 10 h, total volume=10 μL, protein concentration=100 μmol·L-1

    通過光譜分析、電泳、等溫量熱滴定、Tb3+熒光探針和分子對接等方法,在pH=7.4、10 mmol·L-1 Hepes條件下,研究了鈣調蛋白抑制劑CPZ與apoC- EoCen的相互作用。結果表明,CPZ與apoC-EoCen以1:1結合比與apoC-EoCen的4個α-螺旋間的疏水區結合而形成復合物,條件結合常數約為104 L· mol-1;apoC-EoCen具有類核酸酶活性,可將pBR322 DNA切割為切口型??、線型??DNA,而CPZ抑制了apoC-EoCen的類核酸酶活性;CPZ與apoC-EoCen的結合導致蛋白質第Ⅳ結構域的金屬離子結合能力喪失,進而抑制金屬離子結合誘導的聚集;CPZ通過疏水作用占據apoC-EoCen的靶肽結合部位而抑制其與XPC的結合;CPZ還抑制PKA對apoC-EoCen的磷酸化。多種實驗手段證明,CPZ是一種良好的中心蛋白生物功能阻斷劑,在以后的醫學研究中有著良好的應用前景。


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  • 圖 1  鹽酸氯丙嗪的結構

    Figure 1  Structure of chlorpromazine

    圖 2  (A) CPZ (2.5 mmol·L-1)的加入對apoC-EoCen(10 μmol·L-1, 1 mL)熒光光譜的影響; (B)隨cCPZ/capoC-EoCen變化的熒光強度(308 nm)滴定曲線, 以及CPZ滴定apoC-EoCen的擬合曲線

    Figure 2  (A) Fluorescence spectra produced by addition of CPZ (2.5 mmol·L-1) to 1 mL apoC-EoCen (10 μmol·L-1); (B) Titration curve of fluorescent intensity at 308 nm against concentration ratio of CPZ and apoC-EoCen

    Concentration of CPZ from a to u was 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 μmol·L-1, respectively; All experiments were carried out in 10 mmol·L-1 Hepes buffer (pH=7.4); Inset: plot of lg[(F0-F)/(F-F)] vs lg cCPZ, f and fitting curve

    圖 3  25 ℃下CPZ (3 mmol·L-1)對apoC-EoCen (0.08 mmol·L-1)的等溫量熱滴定曲線

    Figure 3  Calorimetric titration curve of CPZ (3 mmol·L-1) to apoC-EoCen (0.08 mmol·L-1) at 25 ℃

    圖 4  apoC-EoCen和apoC-EoCen-CPZ復合物在水中的遠紫外CD光譜

    Figure 4  Far-UV CD spectra of apoC-EoCen and apoC- EoCen-CPZ complex in aqueous solution

    Condition: 10 mmol·L-1 Hepes buffer, pH=7.4, 25 ℃; Ratio of CPZ added to apoC-EoCen (25 μmol·L-1): 0 (a), 10 (b)

    圖 5  (A) apoC-EoCen熒光光譜(a)和CPZ吸收光譜的重疊(b); (B) apoC-EoCen和CPZ的分子對接圖

    Figure 5  (A) Overlap of apoC-EoCen fluorescence spectrum (a) and CPZ absorption spectrum (b); (B) Molecular docking between apoC-EoCen and CPZ

    Cartoon ribbon model structure of apoC-EoCen; Black dotted line represents the distance between Tyr and CPZ; green: apoC-EoCen, yellow: CPZ, purple: Tyr

    圖 6  在CPZ不存在(A)和存在(B)的情況下Tb3+敏化的熒光光譜; (C)在CPZ不存在(a)和存在(b)的情況下, Tb3+在545 nm處的熒光強度與cTb3+/capoC-EoCen的關系; (D) Tb2-apoC-EoCen和Tb-apoC-EoCen-CPZ的遠紫外CD光譜

    Figure 6  Tb3+ sensitized fluorescence spectra in the absence (A) and presence (B) of CPZ; (C) Fluorescence intensity of Tb3+ at 545 nm as a function of cTb3+/capoC-EoCen in the absence (a) and presence (b) of CPZ; (D) Far-UV CD spectra of Tb 2-apoC-EoCen and Tb-apoC-EoCen-CPZ

    Condition: (A) Titrating apoC-EoCen with 1 mmol·L-1 Tb3+, the protein concentration was 10 μmol·L-1, from a to h, the ratios of Tb3+ added to apoC-EoCen were 0, 0.33, 0.66, 1, 1.33, 1.66, 2, 2.33, respectively; (B) cCPZ/capoC-EoCen=10, the experiment condition was the same as A; (C) Fluorescence intensity selected at 545 nm in Fig.A as curve a, and fluorescence intensity at 545 nm in Fig.B as curve b; (D) Ratios of CPZ added to Tb 2-apoC-EoCen were 0 (a), 10 (b), respectively, capoC-EoCen=25 μmol·L-1

    圖 7  (A) Tb3+滴定apoC-EoCen的RLS光譜; (B)在CPZ比例不同(cCPZ/capoC-EoCen=0 (a), 10 (b))的情況下, RLS光譜在280 nm處的強度與cTb3+/capoC-EoCen的關系

    Figure 7  (A) RLS spectra of apoC-EoCen titrated with Tb3+; (B) RLS intensity at 280 nm as a function of cTb3+/capoC-EoCen in the presence of different proportions of CPZ: cCPZ/capoC-EoCen=0 (a), 10 (b)

    apoC-EoCen concentration was 10 μmol·L-1; apoC-EoCen was titrated with 1 mmol·L-1 Tb3+, and the experiments were performed in Hepes (10 mmol·L-1, pH=7.4); from a to h, the ratios of Tb3+ added to apoC-EoCen were 0, 0.33, 0.66, 1, 1.33, 1.66, 2, 2.33, respectively

    圖 8  (A) apoC-EoCen切割pBR322 DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖; (B)不同構型DNA的比例與apoC-EoCen濃度的關系

    Figure 8  (A) Agarose gel electrophoresis for pBR322 DNA cutting with different concentrations of apoC-EoCen; (B) Relationship between proportion of different configurations pBR322 DNA and apoC-EoCen concentration

    10 mmol·L-1 Hepes, pH=7.4, 4 ℃ reaction for 3 h; lane 1: pBR322 DNA, lanes 2~10: 0.003 5 g·L-1 pBR322 DNA added with 2.5, 5, 7.5, 10, 12.5, 15, 17.5, 20 and 25 μmol·L-1 apoC-EoCen, respectively, Vtotal=10 μL

    圖 9  (A) CPZ對apoC-EoCen裂解DNA影響的瓊脂糖凝膠電泳圖; (B)不同構型DNA的比例隨cCPZ/capoC-EoCen變化的曲線

    Figure 9  (A) Agarose gel electrophoresis for effect with different proportions of CPZ on apoC-EoCen cleavaging DNA; (B) Relationship between proportion of different configurations pBR322 DNA and cCPZ/capoC-EoCen

    10 mmol·L-1 Hepes, pH=7.4, at 4 ℃ for 3 h, total volume: 10 μL; Lane 1: pBR322 DNA, lanes 2~10: pBR322 DNA+apoC-EoCen, lanes 3~10: pBR322 DNA+apoC-EoCen+CPZ (cCPZ/capoC-EoCen)=5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, respectively; final pBR322 DNA concentration: 0.003 5 g·L-1

    圖 10  (A) 不同比例的CPZ加入apoC-EoCen和XPC中的天然凝膠電泳圖; (B) apoC-EoCen (a)和apoC-EoCen-XPC (b)隨cCPZ/capoC-EoCen的變化; (C)遠紫外CD光譜中CPZ對apoC-EoCen與XPC復合物的影響(a: apoC-EoCen; b: apoC-EoCen-XPC復合物; c: apoC-EoCen-XPC與CPZ共存); (D) apoC-EoCen與XPC或CPZ結合的緞帶模型

    Figure 10  (A) Non-denaturing gel electrophoresis diagram for effect of adding CPZ with different proportions to apoC-EoCen combined with XPC; (B) apoC-EoCen (a) and apoC-EoCen-XPC (b) changes with cCPZ/capoC-EoCen; (C) Far-UV CD spectra for effect of CPZ on apoC-EoCen binding to XPC (a: apoC-EoCen; b: apoC-EoCen-XPC complex; c: apoC-EoCen-XPC combined with CPZ); (D) Cartoon ribbon model structure of apoC-EoCen combined with XPC and CPZ

    Condition: (A) 10 mmol·L-1 Hepes, pH=7.4, at 4 ℃ for 6 h, total volume=10 μL, protein concentration=200 μmol·L-1; (C) protein concentration=25 μmol·L-1, target peptide ratio=1:1, CPZ concentration=250, 750 μmol·L-1, total volume= 300 μL at 25 ℃; (D) apoC-EoCen (blue), XPC (purple), CPZ (green)

    圖 11  CPZ對apoC-EoCen磷酸化影響的聚丙烯凝膠電泳圖

    Figure 11  Polypropylene gel electrophoresis diagram for effect of CPZ on apoC-Eocen phosphorylation

    10 mmol·L-1 Hepes, pH=7.4, 30 ℃ reaction in a water bath for 10 h, total volume=10 μL, protein concentration=100 μmol·L-1

    表 1  25 ℃下通過ITC和熒光光譜測量CPZ與apoC-EoCen結合的熱力學數據

    Table 1.  Thermodynamics data of CPZ binding with apoC-EoCen measured by ITC and fluorescence spectrometry at 25 ℃

    Method K / (L·mol-1) n ΔS / (J·mol-1) ΔH / (kJ·mol-1) ΔG / (kJ·mol-1)
    ITC (1.12±0.15)×104 1 55.2 -6.77±0.81 -23.51
    Fluorescence (1.91±0.04)×104 0.9
    下載: 導出CSV
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  • 發布日期:  2021-01-10
  • 收稿日期:  2020-08-20
  • 修回日期:  2020-10-28
通訊作者: 陳斌, bchen63@163.com
  • 1. 

    沈陽化工大學材料科學與工程學院 沈陽 110142

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