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三元混配銅(Ⅱ)配合物的晶體結構、DNA作用及其生物活性

蔡戴宏 莫慧雯 何良 樂學義

引用本文: 蔡戴宏, 莫慧雯, 何良, 樂學義. 三元混配銅(Ⅱ)配合物的晶體結構、DNA作用及其生物活性[J]. 無機化學學報, 2021, 37(1): 74-84. doi: 10.11862/CJIC.2021.026 shu
Citation:  CAI Dai-Hong, MO Hui-Wen, HE Liang, LE Xue-Yi. Crystal Structure, DNA Binding Properties and Biological Activities of a Ternary Mixed-Ligand Copper(Ⅱ) Complex[J]. Chinese Journal of Inorganic Chemistry, 2021, 37(1): 74-84. doi: 10.11862/CJIC.2021.026 shu

三元混配銅(Ⅱ)配合物的晶體結構、DNA作用及其生物活性

    通訊作者: 何良, E-mail:heling@scau.edu.cn; 樂學義, E-mail:lexyfu@163.com; Tel:020-85280319
  • 基金項目:

    國家自然科學基金(No.21701195)和廣東省自然科學基金(No.2015A030313423)資助

摘要: 利用溶劑緩慢揮發法合成了以5-氯-2-(2'-吡啶基)苯并咪唑為主配體、L-苯丙氨酸根為輔助配體的三元混配銅(Ⅱ)配合物:[Cu(HPBC)(L-Phe)(H2O)]ClO4(簡稱為1,HPBC=5-氯-2-(2'-吡啶基)苯并咪唑,L-Phe=L-苯丙氨酸根)。采用元素分析、紅外光譜、紫外可見光譜、摩爾電導率測定和電噴霧質譜等手段對配合物1進行了表征,利用X射線單晶衍射確定配合物具有五配位的變形四方錐構型,并通過電子吸收光譜、熒光光譜、粘度測定及分子對接等方法揭示了配合物主要以插入作用的方式與小牛胸腺DNA(CT-DNA)結合。配合物對被測微生物(李斯特菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌)及癌細胞(SGC-7901、Bel-7402、HeLa和A549)顯示出良好的抗菌和細胞毒活性(IC50=1.69~2.50 μmol·L-1)。最重要的是,通過確定細胞的形態變化(AO/EB雙染法)及細胞周期測定分析,揭示了配合物1通過DNA結合的途徑誘導SGC-7901細胞凋亡。

English

  • 腫瘤細胞具有無限增殖、分化以及易擴散等共同特征,目前臨床上廣泛應用順鉑、卡鉑等鉑類配合物進行治療。然而,這類藥物存在交叉耐藥性、對某些腫瘤細胞活性較低、體內不易代謝和嚴重毒副作用等缺點,因此新型、高效的金屬配合物藥物成為熱門研究領域,尤其是低毒的內源性金屬配合物吸引了人們的關注[1-4]。銅(Ⅱ)離子是重要的內源性金屬,具有很強的配位能力,能和大多數芳雜環(含N、S、O、P)有機化合物配位,形成結構復雜、配位模式多變的金屬銅(Ⅱ)配合物。同時,研究發現銅(Ⅱ)配合物與鉑類配合物不同,主要以非共價結合的方式作用于DNA,這種結合方式可以提供更廣泛的抗腫瘤活性[5-7]。2-取代苯并咪唑衍生物具有一定生物活性,可作為配體形成銅(Ⅱ)配合物,并且可通過芳香環上引入不同官能團進一步提高和調節金屬配合物的生物活性。氨基酸為重要的生命內源物質,作為輔助配體與金屬元素形成配合物時,不僅能夠提高配合物的生物活性,而且能夠降低配合物的毒副作用。[8-11]

    基于以上原因,我們以5-氯-2-(2'-吡啶基)苯并咪唑(5-chloro-2-(2'-pyridyl)benzimidazole,HPBC)為主配體、L-苯丙氨酸根(L-phenylalaninate,L-Phe)為輔助配體,合成以銅(Ⅱ)為中心離子的配合物:[Cu(HPBC)(L-Phe)(H2O)]ClO4 (1),并采用元素分析、摩爾電導率和X射線單晶衍射等方法確定了配合物的組成和結構。重要的是,研究了配合物的DNA結合性質與生物性質:如通過電子吸收光譜、熒光光譜、粘度實驗以及分子對接技術研究了配合物與DNA的相互作用方式;分別采用牛津杯法和噻唑藍(3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium,MTT)比色法測定配合物對細菌及腫瘤細胞生長的抑制作用,并通過吖啶橙(acridine orange,AO)/溴化乙錠(ethidium bromide,EB)染色法、流式細胞儀測定細胞周期等方法初步揭示了其抗腫瘤作用機制。

    L-苯丙氨酸、小牛胸腺DNA(calf thymus DNA,CT-DNA)、三羥基氨基甲烷(tris(hydroxymethyl)aminomethane,Tris)、溴化乙錠(ethidium bromide,EB)、牛肉浸膏、細菌學蛋白胨、瓊脂粉、DMEM培養基(dulbecco's modified eagle medium,DMEM)、RPMI-1640培養基(RPMI 1640 medium,RPMI-1640)、胎牛血清、新生牛血清、胰蛋白酶、核糖核酸酶A(Ribonuclease A,RNAse)、碘化丙啶(propidium iodide,PI)均為生化試劑;其他試劑均為市售,純度為分析純。

    所用儀器有:DDS-11A數顯電導率儀,上海雷磁新涇儀器有限公司;ACATAR 360 FT-IR型紅外光譜儀,美國Nnicolet公司;Vario EL Cube元素分析儀,德國Elementar公司;Pharmacia UV-2550紫外-可見分光光度計,日本Shimadzu公司;F-7000熒光光譜儀,日本Hitachi公司;API 3200液質聯用儀,AB Sciex公司;MCO-15AC型二氧化碳培養箱,日本松下電器公司;CKX31-A11RC型倒置顯微鏡,Olympus公司;Varioskan Flash型多功能酶標儀,美國Thermo Scientific公司;ImageXpress Micro XLS高內涵成像分析系統,Molecular Devices公司;FACS Calibur流式細胞儀,美國BD Bioscience。

    根據文獻[12]中的方法制備配體HPBC。

    配合物1的合成:將Cu(ClO4)2水溶液(0.5 mmol,0.504 0 mol·L-1)滴加到含有NaOH(0.5 mmol,0.020 0 g)的L-苯丙氨酸(0.5 mmol,0.082 6 g)水溶液(5 mL)中, 在50 ℃下攪拌反應20 min。隨后, 滴加含有HPBC(0.5 mmol,0.114 8 g)的20 mL乙醇水溶液(3:1,V/V),反應溫度控制在50 ℃左右,此時溶液呈墨綠色,持續攪拌反應1 h。冷卻后過濾,室溫下緩慢揮發10 d析出深藍色晶體,產物用冰無水乙醇快速洗滌??諝飧稍锖竺芊庥跇悠饭軆炔⒈4嬗诟稍锲髦?。

    得到的配合物1易溶于二甲基亞砜(dimethyl sulpoxide,DMSO)、甲醇、乙醇等有機溶劑,但不溶于水。用元素分析儀測定配合物C、H、N原子的百分含量,按C21H20O7N4CuCl2的計算值(%):C,43.87;H,3.51;N,9.75。實驗值(%):C,44.20;H,3.44;N,9.75。IR(KBr,cm-1):3 442(s,ν—OH),3 316(w,ν—NH),3 269(w,νas, —HN2),1 580(s,νas, —COO-),1 445(s,νC═N),1 317(s, νs, —COO-),1 121(s,νas, —COO4-),625(w,νCu—O),428(w,νCu—N)。UV - Vis(甲醇為溶劑),λ/nm(ε/(L·mol-1·cm-1)):208 (28 739)、327(18 600)、627(62.65),分別歸屬于配體雜環的 n-π*、π-π*遷移和中心銅離子的d-d 躍遷。ESI - MS(甲醇):m/z=457.8,對應于[Cu(HPBC) (L-Phe)]+。電導率測定(甲醇):Λ=84 S·cm2·mol-1,表明配合物為1:1型電解質。

    1的母液中選擇合適尺寸的單晶安裝在玻璃纖維上,使用裝有CCD面積檢測器的Brucker Smart 1000衍射儀(石墨單色分光Cu 射線,λ=0.154 18 nm),在293(2) K下進行φ-ω掃描,以收集配合物的X射線單晶衍射強度數據。通過SAINT程序進行數據還原,并使用半經驗多掃描方法(SADABS)進行了經驗吸收校正[13]。所有計算應用SHELXL-2014程序包[14],采用直接法解析配合物的晶體結構,在數輪差值Fourier合成中陸續確定非氫原子的坐標,再采用全矩陣最小二乘法修正所有非氫原子坐標及其各向異性熱參數。通過Fourier加氫法確定與氧相連的氫原子位置,理論加氫方法確定其他氫原子位置[7, 15-16]。配合物1的晶體學數據和結構精修參數列于表 1。使用SHELXLT XP升級包,并以30%的概率繪制水平熱橢圓體分子結構圖。

    CCDC:2032899。

    表 1

    表 1  配合物1的晶體學數據及結構精修參數
    Table 1.  Crystallographic data and details of refinements for complex 1
    下載: 導出CSV
    Empirical formula C21H20Cl2CuN4O7 Crystal size / mm 0.1×0.1×0.1
    Formula weight 574.86 θ range for data collection / (°) 4.26~63.07
    Crystal system Orthorhombic Index ranges -12 ≤ h ≤11; -16 ≤ k ≤ 13; -17 ≤ l ≤ 17
    Space group P212121 Reflection collected 5 965
    a / nm 1.089 56(4) Independent reflection 3 458
    b / nm 1.394 46(5) Rint 0.034 2
    c / nm 1.554 87(5) Refinement method Full-matrix least-squares on F 2
    V / nm3 2.362 3(1) Data, restraint, parameter 3 458, 31, 326
    Z 4 Goodness-of-fit on F 2 1.074
    Dc/ (g·cm-3) 1.608 Final R indices [I > 2σ(I)] R1=0.060 2, wR2=0.170 9
    μ / mm-1 3.838 R indices (all data) R1=0.062 0, wR2=0.175 1
    F(000) 1 168 Largest diff. peak and hole / (e·nm-3) -550 and 1 196

    Tris-HCl/NaCl緩沖溶液(pH=7.2)的配制:稱取0.06 g三羥甲基氨基甲烷(Tris)和0.29 g NaCl溶解于約95 mL去離子水中,再用稀鹽酸調pH值至7.2并用去離子水定容至100 mL。后續實驗的配合物溶液均用此緩沖溶液配制。

    室溫下,用UV-2550紫外-可見分光光度計在200~550 nm的范圍內測定了含配合物(100 μmol· L-1)的Tris-HCl/NaCl緩沖溶液(pH=7.2)在0、24和48h時的紫外-可見(UV-Vis)光譜。

    DNA溶液的配制:稱取約1 mg·mL-1的CT-DNA溶解于Tris -HCl/NaCl緩沖溶液中(約為1.5 mmol· L-1),小心振蕩后放入冰箱過夜,待DNA充分溶解后測定DNA溶液在260和280 nm處的吸光度,A260/A280 =1.8~1.9時,表明基本不含蛋白質,不需進一步處理。CT-DNA的濃度以堿基對的物質的量濃度(mol· L-1)計,通過測定DNA在260 nm處吸光度A260(ε=6 600 L·mol-1·cm-1),然后按下式(式1)計算[17]cDNA= KA260/ 6 600,其中K 為稀釋倍數。為保證實驗結果的可靠性,配制好的DNA母液放置在4 ℃下保存,且4 d內使用。后續實驗所需的DNA溶液按需用母液稀釋到一定濃度。

    1.5.1   紫外可見吸收滴定實驗

    通過保持配合物1的濃度恒定(50 μmol·L-1)和改變CT-DNA濃度(0~45 μmol·L-1)來進行吸收滴定實驗。以Tris-HCl/NaCl緩沖溶液(pH=7.2)為掃描基線,扣除空白背景。樣品池中加入3 mL不含DNA的配合物溶液,測定其在200~450 nm范圍內的電子吸收光譜。為了消除由于DNA引起的吸光度變化的影響,依次滴加等量(20 μL)的CT-DNA(1 mmol· L-1)溶液到參比池和樣品池中,每次滴加DNA溶液后使其與配合物室溫反應5 min,然后進行掃描。

    1.5.2   熒光光譜測定

    在熒光猝滅研究中,CT-DNA和EB的濃度保持恒定(分別為10和8 μmol·L-1,提前混勻并靜置12 h)。具體測定過程是:往樣品池中加入3 mL的EB-CT-DNA混合溶液,在240 nm·s-1、激發波長為525 nm的條件下,測定其在540~700 nm范圍內的熒光發射光譜。然后,依次往EB-CT-DNA體系中滴加等體積配合物1溶液(1 mmol·L-1,每次20 μL,體系濃度變化范圍為0~45 μmol·L-1),每次滴加后混勻,室溫下孵育8 min,再測定其發射光譜。

    1.5.3   粘度測定實驗

    用恒溫水槽控制測定溫度在(29.0±0.1) ℃,使用烏氏粘度計測定在Tris-HCl緩沖液(pH=7.2)中不存在和存在配合物1時CT-DNA(200 μmol·L-1)溶液的粘度,ccomplex/cDNA比率為0~0.30,對每個樣品測量3次以確保準確性,并計算平均流動時間,同時使用EB作為陽性對照。所測溶液的相對粘度按公式η=(t-t0)/t0計算[18],其中t0為緩沖溶液Tris-HCl/NaCl的流動時間,t為含不同濃度配合物的CT-DNA溶液的流動時間。以(η/η0)1/3(η0為未加配合物時DNA溶液的比粘度)對ccomplex/cDNA作圖,可以觀察到配合物對DNA粘度的影響。

    1.5.4   分子對接

    使用Mercury軟件將X射線單晶衍射的CIF文件轉換為PDB格式,得到配合物1的初始結構。在進行對接計算之前,去除配合物的游離高氯酸根和配位水分子。對接使用DNA d(5'-G-dIU-TGCAAC- 3')(PDB ID:454D)的晶體結構,對接前去除其中的水分子,添加極性氫原子并計算出Gasteiger電荷。整個分子對接過程在AutoDock 4.2軟件上進行,使用大小為50×50×50的盒子將配體分子可能結合的區域包裹住,格點間隔為0.037 5 nm,配合物在DNA中的中心坐標為:x=29.581、y=19.637、z=70.656。采用Lamarckian遺傳算法進行對接模擬,計算輪數為100次,其他參數保持默認設置。計算結果采用AutoDock 1.5.6進行分析,配合物與DNA相互作用的結果根據能量最低原則進行分析,并應用PyMol軟件畫出對接結果[19-20]。

    抗菌實驗所用菌種金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S. aureus,G+)、李斯特菌(Listeria monocytogenes,L. mono,G+)、大腸桿菌(Escherichia coli,E. coli,G-)及綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa,P. aeruginosa,G-)由廣東省植物分子育種重點實驗室提供。通過牛津杯法以抑制區為指標,分別測定了HPBC、Cu(ClO4)2和配合物的抗菌活性,每個實驗設3組平行,所有設備和培養基實驗前均已滅菌。

    牛津杯法:用含2% DMSO的無菌水配制化合物溶液,濃度均為2 mmol·L-1。在超凈工作臺上,移取100 μL的菌懸液(1×106 CFU·mL-1)于固體培養基上,涂布均勻并稍稍晾干,將無菌牛津杯置于含菌的固體培養基上面,然后分別將配合物、HPBC、Cu(ClO4)2及含2% DMSO的無菌水(100 μL)加入牛津杯中,置于37 ℃的恒溫恒濕培養箱里培養24 h。用十字交叉方法測量其抑菌圈的直徑,并取平均值。

    1.7.1   體外細胞毒性研究

    采用MTT法對由中山大學實驗動物中心提供的人宮頸腫瘤細胞(HeLa)、人肝癌細胞(BEL-7402)、人肺癌細胞(A549)、人胃癌細胞(SGC-7901)和人正常肝細胞(LO2)分別進行篩選,并以順鉑為陽性對照,評估配合物的體外細胞毒性。具體過程為:將實驗細胞接種在96孔板(Costar,Corning Corp,New York)中,每孔細胞密度約為1×104個,并在37 ℃、CO2體積分數5%的培養箱中孵育,直到細胞貼壁生長至70%~80%。加入不同濃度梯度的配體及其配合物(1.57、3.13、6.25、12.5、25、50、100 μmol·L-1)作用48 h,每組設置4個平行復孔,且設置培養液作為空白對照孔。之后,棄去培養液,各孔都加入不含血清的RPMI-1640(或DMEM)培養基90 μL和MTT溶液10 μL(5 mg·mL-1),然后繼續培養4 h,丟棄培養基,并將藍色甲瓚固體完全溶解于DMSO中(每孔100 μL),使用多功能酶標儀測定各孔在490 nm處的光密度值,通過在對數圖上繪制細胞生存率百分比與配合物濃度的關系,求出IC50[21]。配合物抑制各種細胞增殖的活性較好,因此降低濃度梯度(0.5、1、2、3、4、5、6 μmol·L-1),進行二次篩選。

    1.7.2   細胞凋亡形態

    利用AO/EB染色法對凋亡細胞的形態學進行定性分析。將生長狀態良好的SGC-7901細胞以每孔1×105個細胞的密度接種于12孔板中,在CO2體積分數5%的培養箱中恒溫(37 ℃)孵育24 h后,加入不同濃度配合物(0.85、1.69 μmol·L-1)處理細胞24 h,同時設置空白組。配合物作用后棄去孔中的培養液,用PBS緩沖液清洗2次,每孔加入200 μL AO/EB混合染液(100 μg·mL-1 AO,100 μg·mL-1 EB,現配現用),于37 ℃下避光染色20 min后,棄去染液并用PBS清洗細胞。使用高內涵細胞成像系統觀察細胞形態并進行拍照(整個實驗應盡量避光處理)。

    1.7.3   流式細胞儀檢測細胞周期

    將SGC-7901細胞以每孔1×106個細胞的密度接種到六孔板中,并在CO2體積分數5%的氣氛中恒溫(37 ℃)孵育24 h。除去培養基,用含有不同濃度的配合物(0.85、1.69、2.53 μmol·L-1)的培養基處理細胞24 h后,用胰蛋白酶消化細胞,收集離心后用冷PBS洗滌,再用體積分數70%的乙醇重懸細胞并在4 ℃下固定細胞5 h。清洗后,將20 μL的RNAse(0.2mg·mL-1)和20 μL PI(0.02 mg·mL-1)加入細胞懸浮液中,并將混合物在37 ℃下孵育30 min。最后用FACS Calibur流式細胞儀分析樣品,數據應用FlowJo軟件進行分析[22]。

    配合物1的部分鍵長和鍵角數據列于表 2,氫鍵數據列于表 3,其分子結構如圖 1所示。

    表 2

    表 2  配合物1的部分鍵長(nm)和部分鍵角(°)
    Table 2.  Selected bond lengths (nm) and angles (°) for complex 1
    下載: 導出CSV
    Cu1—O1 0.195 3(4) Cu1-N2 0.197 3(5) C10-Cl1' 0.168 9(9)
    Cu1—N1 0.203 8(4) Cu1-O3 0.232 1(5)
    Cu1—N4 0.200 9(4) C11-Cl1 0.163 1(11)
    N2—Cu1—N1 80.58(20) O1-Cu1-N2 172.76(20) N4-Cu1-O3 90.94(22)
    O1—Cu1—N1 92.79(18) O1-Cu1-O3 95.83(17) N4-Cu1-N1 158.24(19)
    O1—Cu1—N4 82.06(18) N2-Cu1-O3 89.23(20)
    N2—Cu1—N4 103.06(21) N1-Cu1-O3 110.67(21)

    表 3

    表 3  配合物1的部分氫鍵參數
    Table 3.  Selected hydrogen bond parameters of complex 1
    下載: 導出CSV
    D—H…A d(D—H) / nm d(H…A) / nm d(D…A) / nm ∠DHA / (°)
    N3—H3…O2#1 0.086 0.194 0.277 4(7) 162
    O3—H3A…O2 0.102 0.258 0.295 7(7) 101
    O3—H3A…C11'#2 0.102 0.257 0.335 0(7) 133
    O3—H3B…O6#3 0.102 0.201 0.291 9(12) 147
    N4—H4A…O4#3 0.090 0.221 0.293 8(11) 138
    N4—H4B…O7#4 0.090 0.219 0.304 8(12) 159
    Symmetry codes: #1: -x+2, y-1/2, -z-1/2; #2: x+1/2, -y+1/2, -z-1; #3: x+1/2, -y+1/2, -z; #4: -x+1/2, -y, z-1/2.

    圖 1

    圖 1.  配合物1的橢球幾率為30%的分子結構圖
    Figure 1.  Molecular structure of complex 1 with thermal ellipsoids at 30% probability level

    單晶分析結果表明,配合物1屬于正交晶系,空間群為 P212121。晶體由陽離子[Cu(HPBC) (L -Phe)(H2O)]+和陰離子ClO4-構成。在配合物陽離子中,每個Cu離子和1個HPBC配體(2個N原子)、1個L- Phe配體(氨基N原子和羧基O原子)及H2O(O原子)作用形成五配位的構型,這些結果與配合物的元素分析、紅外光譜、紫外光譜、摩爾電導率測定及電噴霧質譜測定結果一致。另外,由于配體HPBC在溶液中易產生互變異構,結果產生的固態配合物分子中氯取代基存在著位置異構(2套無序結構在C10與C11位置各占50%)。并且發現,該配合物分子結構與文獻報道的配合物[Cu(L-Val)(pzta)(H2O)]ClO4和[Cu(L-Thr)(pzta)(H2O)]ClO4相似[16]。

    按照Addison/Reedijk幾何構型判斷標準,通過計算τ 參數(τ=(β-α)/60)來初步揭示五配位配合物的變形程度[23]。計算獲得配合物的τ 值為0.24,表明配合物為變形四方錐構型[24]。由表 2可知,配合物軸向原子到中心銅離子的距離為0.232 1 nm,大于赤道鍵(0.195 3~0.201 4 nm),表明配位水對中心Cu離子的配位作用較其他配體弱。此外,Cu1-N2的鍵長略短于Cu1-N1的鍵長,表明HPBC配體中咪唑N原子配位能力強于吡啶N原子,這歸因于前者周圍具有相對較大的電子云密度。

    另外,配合物晶胞堆積圖(圖 2)揭示了配合物晶體中配位陽離子[Cu(HPBC)(L-Phe)(H2O)]+之間存在著大量的氫鍵(表 3列出部分氫鍵參數)和芳環堆積作用(分子平面間質心間距離為0.343 nm,垂直距離為0.322 nm),這些作用穩定了配合物的晶體結構。

    圖 2

    圖 2.  配合物1的晶胞堆積圖
    Figure 2.  Unit cell packing diagram of complex 1

    圖 3表明,在Tris-HCl/NaCl緩沖液(pH 7.2)中,配合物的UV-Vis光譜隨時間增長基本保持不變,表明配合物在溶液中能穩定存在[25-26]。因此,我們認為該配合物在后續的實驗過程中是穩定的。

    圖 3

    圖 3.  配合物1在Tris-HCl/NaCl緩沖液(pH=7.2)中的紫外可見光譜
    Figure 3.  UV-Vis spectra of complex 1 in Tris-HCl/NaCl buffer (pH=7.2)
    2.3.1   電子吸收光譜

    圖 4顯示了在不存在和存在CT-DNA的情況下配合物的電子吸收光譜,虛線表示未加入CT-DNA時,配合物在Tris(pH=7.2)緩沖溶液中的紫外可見吸收光譜。吸收峰的強度隨DNA濃度的增加而降低(減色率為32.65%,紅移2 nm),這表明配合物可能通過插入模式與DNA結合[27]。為了評估配合物與CT-DNA結合的親和力,可以使用以下公式(式2)計算內在結合常數(Kb) [28]cDNA/(εa-εf)=cDNA/(εb-εf)+1/[Kb(εb-εf)],式中cDNA表示CT-DNA的濃度,εa、εfεb分別表示Aobs/cCu、自由配合物的摩爾吸光系數、與CT-DNA完全結合后的配合物的摩爾吸光系數。通過cDNA/ (εb-εf)對cDNA作圖,得到的斜率和截距的比值即為配合物與DNA的結合常數Kb[29]。獲得配合物的結合常數Kb=3.03×104 L·mol-1,小于經典插入試劑EB的結合常數(1.4×106 L·mol-1) [15],這可能是由于HPBC配體的芳平面結構相對較小[30],導致配合物的插入作用較弱。

    圖 4

    圖 4.  配合物1 (50 μmol·L-1)在不同CT-DNA濃度下的電子吸收光譜圖
    Figure 4.  Electronic absorption spectra of complex 1 (50 μmol·L-1) in the absence and presence of CT-DNA

    Arrow indicates that the ultraviolet absorption peak of complex 1 changes with the increase of DNA concentration; Inset: linear plot of cDNA/(εa-εf) vs cDNA

    2.3.2   競爭性DNA結合實驗

    配合物對EB-CT-DNA體系的熒光猝滅光譜如圖 5所示。顯然,隨著體系中配合物濃度不斷增加,熒光強度不斷減弱,發生了猝滅現象(熒光淬滅率為24.35%),表明配合物擠出了DNA堿基對間的EB,從而形成新的配合物-CT-DNA體系,即配合物與CT - DNA發生了插入結合作用。根據經典的Stern - Volmer公式(式3)可定量計算出熒光猝滅常數KSV[31]F0 /F=1+KSVccomplex,其中,F0F分別表示未加入和加入配合物時EB-CT-DNA體系的熒光強度,ccomplex表示配合物的濃度。以F0/Fccomplex作圖獲得直線的斜率即為KSV值。獲得配合物對EB-DNA體系的熒光猝滅常數為5.365×103 L·mol-1,稍小于文獻中結構相似的銅配合物[32-33],即揭示了該配合物對DNA的插入結合作用較弱,與上述電子吸收光譜方法測定結果一致。

    圖 5

    圖 5.  配合物1對EB-CT-DNA體系熒光強度的影響
    Figure 5.  Emission spectra of EB-CT-DNA in the absence and presence of complex 1

    Tris-HCl buffer, pH=7.2; Arrow shows the fluorescence intensity changing upon the increase of complex 1 concentration; Inset: linear plot of F0/F vs ccomplex

    2.3.3   粘度測定

    DNA粘度對其鏈長度變化比較敏感,是檢測溶液狀態下配合物與DNA相互作用模式的最有效的手段[34]。圖 6表明,隨著EB濃度的增加,DNA溶液的相對粘度大幅度增加; 而隨著配合物的濃度不斷增加, CT-DNA溶液的相對粘度有所升高但趨勢并不明顯, 結合以上光譜方法實驗結果,推測配合物與DNA之間具有弱的插入作用。

    圖 6

    圖 6.  不同濃度的配合物1或EB對CT-DNA溶液相對粘度的影響
    Figure 6.  Effect of increasing concentration of complex 1 or EB on relative viscosity of CT-DNA
    2.3.4   分子對接

    將合成的配合物與DNA(PDB ID:454D)進行了分子對接模擬,以揭示配合物與DNA之間的相互作用方式。本工作對配合物與DNA分子對接100次的結果進行能量分析,并根據能量最低原則,選取能量最低時所對應的結合狀態如圖 7所示。結果表明,配合物與DNA之間的結合能為-35.10 kJ·mol-1,配合物通過其疏水性的芳雜環配體HPBC插入到了DNA中心位置的GC/GC堿基的空腔之間(配體與堿基間距離為0.36 nm),表明配合物與DNA之間存在插入作用,印證了上述實驗得到的結論。同時,配合物與DNA之間形成了一個氫鍵:Complex:H4A…454D:DC5-5:O5'(0.20 nm),這種作用進一步增強了配合物與DNA的作用。

    圖 7

    圖 7.  配合物1與DNA(PDB ID: 454D)作用的分子對接模型圖
    Figure 7.  Molecular docking of DNA(PDB ID: 454D)-complex 1 interactions

    用含2% DMSO的無菌水作為陰性對照,測得HPBC、Cu(ClO4)2和配合物1對S. aureus (G+)、L. mono (G+)、E. coli (G-)及P. aeruginosa (G-)等4種細菌的抑菌圈直徑如表 4所示。

    表 4

    表 4  HPBC、Cu(ClO4)2及配合物1對不同菌種的抑制活性
    Table 4.  Inhibitory activity of HPBC, Cu(ClO4)2 and complex 1 against different microorganisms
    下載: 導出CSV
    Compound Inhibition zone diameter / mm
    S. aureus (G+) L. mono (G+) E. coli (G-) P. aeruginosa (G-)
    2% DMSO
    HPBC
    Cu(ClO4)2 8.33±0.15 9.17±0.35 10.33±0.42
    1 18.60±1.04 21.97±0.25 24.00±0.92 7.17±0.15

    結果表明,含2% DMSO的無菌水及配體HPBC無抗菌活性,且在相同測試濃度和同一菌種的條件下,配合物的抑菌圈直徑明顯大于Cu(ClO4)2,表明配合物有相對較強的抑菌活性,這可能與金屬銅(Ⅱ)離子與配體HPBC間的螯合作用有關。中心銅(Ⅱ)離子與HPBC配位后,其正電荷部分轉移到配體上而產生了離域效應,進而增加了脂溶性,更容易穿透細菌細胞膜[35]進而抑制細菌的生長。另外,配合物對2種革蘭氏陽性菌(S. aureus、L. mono)都具有較好的抑菌活性,但對革蘭氏陰性菌具有選擇性,能抑制E. coli(G-)的增長,但對P. aeruginosa (G-)的抑制活性并不明顯,這可能歸因于革蘭氏陽性菌與陰性菌的細胞壁組成成分及結構明顯不同[36]:革蘭氏陽性菌細胞壁較厚,但結構較簡單,含大量的肽聚糖及磷壁酸;而革蘭氏陰性菌細胞壁較薄,但結構較復雜,分為外壁層和內壁層,主要含有脂多糖和脂蛋白。這導致這2類細菌對某些藥物的敏感性有很大差異[37-38]。

    2.5.1   體外細胞毒性

    采用標準MTT比色法測得配體HPBC、配合物1和順鉑對各種細胞的毒性作用如圖 8、表 5所示。

    圖 8

    圖 8.  配合物1與順鉑的細胞毒性IC50值柱狀圖
    Figure 8.  Histogram of IC50 values for the cytotoxicity of complex 1 and cisplatin

    表 5

    表 5  配體HPBC及配合物1的體外細胞毒性
    Table 5.  In vitro cytotoxicity of HPBC and complex 1
    下載: 導出CSV
    Compound IC50 / (μmol·L-1)
    SGC-7901 A549 Hela BEL-7402 LO2
    HPBC > 100 96.61±3.53 86.10±7.03 > 100 > 100
    1 1.69±0.06 1.74±0.07 2.37±0.19 2.50±0.03 3.18±0.13
    Cisplatin 14.29±0.07 13.85±0.86 9.40±0.37 28.62±0.72 25.69±0.29

    圖 8表 5表明,與配體相比,配合物1對4種癌細胞株的抑制活性顯著增強,具有廣譜的細胞毒性,且抑制活性強于傳統抗癌藥物順鉑,但對人正常肝細胞(LO2)的選擇性仍然較低。與結構相似配合物[Cu(HPBM) (L-Phe) (H2O)]ClO4(IC50值為5.7~8.3 μmol·L-1)[39]相比,1的細胞毒性進一步增強,這可能主要歸因于HPBC中鹵素(—Cl)取代基與芳香苯并咪唑環形成p-π 共軛體系,導致環上π 電子云密度加大從而可增強配合物的脂溶性、提高配合物與細胞的親和力,進而增強其細胞毒性作用[40-41]。此外,配合物對不同腫瘤細胞株的抑制活性大小為SGC-7901 > A549 > HeLa > BEL-7402,即對胃癌細胞的抑制效果最為顯著(IC50=1.69 μmol·L-1),故選用SGC-7901細胞進行后續機制探究實驗。

    2.5.2   AO/EB染色

    為觀察配合物1作用后細胞的形態學變化,采用AO/EB雙染法進行分析。分別用0.85和1.69 μmol·L-1的配合物1作用于SGC-7901細胞,經AO/ EB染色后拍照,結果如圖 9所示。從圖中可以觀察到,正常SGC-7901細胞(a)的細胞核形態正常且細胞質分布均勻,呈現均勻的淺綠色熒光。當以不同濃度配合物處理細胞24 h后,發現細胞變圓,細胞質分布不均勻,細胞核固縮,出現了亮綠色的熒光,并且隨著配合物濃度的增大細胞固縮更加明顯,表明主題配合物可以誘導細胞發生凋亡并存在濃度依賴性。

    圖 9

    圖 9.  不同濃度配合物1作用于SGC-7901細胞24 h的凋亡形態分析
    Figure 9.  Apoptosis morphology analysis of SGC-7901 cells exposed to different concentrations of complex 1 for 24 h

    (a)Blank control, (b) 0.85 μmol·L-1, (c) 1.69 μmol·L-1

    2.5.3   細胞周期阻滯

    經配合物1作用后,使用流式細胞儀對經PI染色的細胞進行分析,細胞周期分布如圖 10所示。結果表明,在空白組細胞中,處于G2/M期的細胞比例為22.39%,經不同濃度配合物1作用24 h后,G2/M期的細胞比例分別為30.45%(0.85 μmol·L-1)、33.19%(1.69 μmol·L-1)和48.81%(2.53 μmol·L-1),處于該期的細胞比例分別增加了8.06%、10.80%和22.42%。與此相對應的是,處于G0/G1期的細胞相應減少,揭示了配合物1可將細胞周期阻滯在G2/M期。

    圖 10

    圖 10.  不同濃度配合物1對SGC-7901細胞周期的影響
    Figure 10.  Effect of different concentrations of complex 1 on SGC-7901 cell cycle

    (a) Blank control, (b) 0.85 μmol·L-1, (c) 1.69 μmol·L-1, (d) 2.53 μmol·L-1

    合成、表征了新的三元銅(Ⅱ)配合物[Cu(HPBC)(L-Phe)(H2O)]ClO4,該配合物具有五配位的變形四方錐構型。多種實驗結果表明,配合物通過插入方式與DNA相互作用,并且分子對接結果進一步揭示了配合物通過芳雜環配體插入到GC/GC殘基區域的空腔中。生物實驗結果表明該配合物對實驗測試的部分細菌(S. aureus、L. mono、E. coli)和所有腫瘤細胞表現出良好的抗微生物活性和細胞毒性作用。其中,配合物對SGC-7901細胞抑制活性最強且遠大于順鉑,同時揭示了配合物通過DNA結合的途徑損傷DNA,將細胞周期阻滯在G2/M期并進一步誘導SGC-7901細胞凋亡。研究結果對設計、合成新的抗菌、抗腫瘤活性金屬配合物藥物具有一定意義。


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  • 圖 1  配合物1的橢球幾率為30%的分子結構圖

    Figure 1  Molecular structure of complex 1 with thermal ellipsoids at 30% probability level

    圖 2  配合物1的晶胞堆積圖

    Figure 2  Unit cell packing diagram of complex 1

    圖 3  配合物1在Tris-HCl/NaCl緩沖液(pH=7.2)中的紫外可見光譜

    Figure 3  UV-Vis spectra of complex 1 in Tris-HCl/NaCl buffer (pH=7.2)

    圖 4  配合物1 (50 μmol·L-1)在不同CT-DNA濃度下的電子吸收光譜圖

    Figure 4  Electronic absorption spectra of complex 1 (50 μmol·L-1) in the absence and presence of CT-DNA

    Arrow indicates that the ultraviolet absorption peak of complex 1 changes with the increase of DNA concentration; Inset: linear plot of cDNA/(εa-εf) vs cDNA

    圖 5  配合物1對EB-CT-DNA體系熒光強度的影響

    Figure 5  Emission spectra of EB-CT-DNA in the absence and presence of complex 1

    Tris-HCl buffer, pH=7.2; Arrow shows the fluorescence intensity changing upon the increase of complex 1 concentration; Inset: linear plot of F0/F vs ccomplex

    圖 6  不同濃度的配合物1或EB對CT-DNA溶液相對粘度的影響

    Figure 6  Effect of increasing concentration of complex 1 or EB on relative viscosity of CT-DNA

    圖 7  配合物1與DNA(PDB ID: 454D)作用的分子對接模型圖

    Figure 7  Molecular docking of DNA(PDB ID: 454D)-complex 1 interactions

    圖 8  配合物1與順鉑的細胞毒性IC50值柱狀圖

    Figure 8  Histogram of IC50 values for the cytotoxicity of complex 1 and cisplatin

    圖 9  不同濃度配合物1作用于SGC-7901細胞24 h的凋亡形態分析

    Figure 9  Apoptosis morphology analysis of SGC-7901 cells exposed to different concentrations of complex 1 for 24 h

    (a)Blank control, (b) 0.85 μmol·L-1, (c) 1.69 μmol·L-1

    圖 10  不同濃度配合物1對SGC-7901細胞周期的影響

    Figure 10  Effect of different concentrations of complex 1 on SGC-7901 cell cycle

    (a) Blank control, (b) 0.85 μmol·L-1, (c) 1.69 μmol·L-1, (d) 2.53 μmol·L-1

    表 1  配合物1的晶體學數據及結構精修參數

    Table 1.  Crystallographic data and details of refinements for complex 1

    Empirical formula C21H20Cl2CuN4O7 Crystal size / mm 0.1×0.1×0.1
    Formula weight 574.86 θ range for data collection / (°) 4.26~63.07
    Crystal system Orthorhombic Index ranges -12 ≤ h ≤11; -16 ≤ k ≤ 13; -17 ≤ l ≤ 17
    Space group P212121 Reflection collected 5 965
    a / nm 1.089 56(4) Independent reflection 3 458
    b / nm 1.394 46(5) Rint 0.034 2
    c / nm 1.554 87(5) Refinement method Full-matrix least-squares on F 2
    V / nm3 2.362 3(1) Data, restraint, parameter 3 458, 31, 326
    Z 4 Goodness-of-fit on F 2 1.074
    Dc/ (g·cm-3) 1.608 Final R indices [I > 2σ(I)] R1=0.060 2, wR2=0.170 9
    μ / mm-1 3.838 R indices (all data) R1=0.062 0, wR2=0.175 1
    F(000) 1 168 Largest diff. peak and hole / (e·nm-3) -550 and 1 196
    下載: 導出CSV

    表 2  配合物1的部分鍵長(nm)和部分鍵角(°)

    Table 2.  Selected bond lengths (nm) and angles (°) for complex 1

    Cu1—O1 0.195 3(4) Cu1-N2 0.197 3(5) C10-Cl1' 0.168 9(9)
    Cu1—N1 0.203 8(4) Cu1-O3 0.232 1(5)
    Cu1—N4 0.200 9(4) C11-Cl1 0.163 1(11)
    N2—Cu1—N1 80.58(20) O1-Cu1-N2 172.76(20) N4-Cu1-O3 90.94(22)
    O1—Cu1—N1 92.79(18) O1-Cu1-O3 95.83(17) N4-Cu1-N1 158.24(19)
    O1—Cu1—N4 82.06(18) N2-Cu1-O3 89.23(20)
    N2—Cu1—N4 103.06(21) N1-Cu1-O3 110.67(21)
    下載: 導出CSV

    表 3  配合物1的部分氫鍵參數

    Table 3.  Selected hydrogen bond parameters of complex 1

    D—H…A d(D—H) / nm d(H…A) / nm d(D…A) / nm ∠DHA / (°)
    N3—H3…O2#1 0.086 0.194 0.277 4(7) 162
    O3—H3A…O2 0.102 0.258 0.295 7(7) 101
    O3—H3A…C11'#2 0.102 0.257 0.335 0(7) 133
    O3—H3B…O6#3 0.102 0.201 0.291 9(12) 147
    N4—H4A…O4#3 0.090 0.221 0.293 8(11) 138
    N4—H4B…O7#4 0.090 0.219 0.304 8(12) 159
    Symmetry codes: #1: -x+2, y-1/2, -z-1/2; #2: x+1/2, -y+1/2, -z-1; #3: x+1/2, -y+1/2, -z; #4: -x+1/2, -y, z-1/2.
    下載: 導出CSV

    表 4  HPBC、Cu(ClO4)2及配合物1對不同菌種的抑制活性

    Table 4.  Inhibitory activity of HPBC, Cu(ClO4)2 and complex 1 against different microorganisms

    Compound Inhibition zone diameter / mm
    S. aureus (G+) L. mono (G+) E. coli (G-) P. aeruginosa (G-)
    2% DMSO
    HPBC
    Cu(ClO4)2 8.33±0.15 9.17±0.35 10.33±0.42
    1 18.60±1.04 21.97±0.25 24.00±0.92 7.17±0.15
    下載: 導出CSV

    表 5  配體HPBC及配合物1的體外細胞毒性

    Table 5.  In vitro cytotoxicity of HPBC and complex 1

    Compound IC50 / (μmol·L-1)
    SGC-7901 A549 Hela BEL-7402 LO2
    HPBC > 100 96.61±3.53 86.10±7.03 > 100 > 100
    1 1.69±0.06 1.74±0.07 2.37±0.19 2.50±0.03 3.18±0.13
    Cisplatin 14.29±0.07 13.85±0.86 9.40±0.37 28.62±0.72 25.69±0.29
    下載: 導出CSV
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  • 發布日期:  2021-01-10
  • 收稿日期:  2020-07-06
  • 修回日期:  2020-10-28
通訊作者: 陳斌, bchen63@163.com
  • 1. 

    沈陽化工大學材料科學與工程學院 沈陽 110142

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